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引物合成常见问题分析及对策
来源:金开瑞 点击: 作者:金开瑞 发布时间:2016-07-08 10:10:38

1、 如何溶解引物?

答:干燥后的引物质地非常疏松,开盖前需先离心,将引物粉末收集到管底。根据说明书上的公式计算出的体积加入去离子无菌水或10mM Tris pH7.5缓冲液,室温放置几分钟,振荡助溶,离心将溶液收集到管底。

溶解引物用的水一般不要用蒸馏水,因为有些蒸馏水的pH值比较低(pH4-5),引物在这种条件下不稳定。


2、 如何保存引物?

答:引物合成后,经过一系列处理和纯化步骤,旋转干燥而成片状物质。溶解前的引物在室温状态下可以长期保存。溶解后的引物-20度可以长期保存。如果对实验的重复性要求较高,合成的OD数较大,建议分装,避免反复冻融。修饰荧光引物需避光保存。


3、测序发现引物有突变是怎么回事?

答:测序发现引物区域有突变,特别是40个碱基以下的引物,发生的概率很小,但是也会存在。您所提交引物序列一般是通过电脑直接COPY到合成仪的,我们也有一套控制办法,预防碱基输入错误,基本不存在人工输错的现象。


引物合成是一种多步骤的化学反应,合成效率最高为99%,副产品不可以避免。在合成过程中,造成碱基插入,缺失,置换突变的因素客观存在。引物序列 中插入突变往往是碱基重复,一般认为,偶连过程中,正在偶连的部分单体发生丢失DMT,导致单体又接了上去,故发生插入同一碱基的突变。缺失突变,一般认 为是带帽(capping)反应不彻底造成的,Caping反应主要是封闭极少数5'-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物,在下一轮偶连时将不能继续参 与合成。对于碱基置换的突变,产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护,即引物上可能含有残留保护基团,引物的这些区域不能很好地与互补链配对,当扩 增的产品被亚克隆转化到大肠杆菌中,可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G 转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体 (脱嘌呤),2,6 diaminopurine , DNA复制和扩增过程中DNA聚合酶将2,6 diaminopurine看作碱基A,测序就会发现碱基G-A置换。脱嘌呤现象在富含嘌呤的引物中发生的频率较高。脱嘌呤的引物在引物后处理脱保护阶段 如果被降解,测序就会发现碱基G或A的缺失。


目前引物突变的问题并没有办法彻底解决,一些降低突变发生的频率建议和措施还停留在实验室阶段,不能应用于规模化生产。引物合成的固相合成原理都一 样,采 用的机器也基本相同,合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的,所有合成服务商都会遇到类似问题,没有人可以超脱。

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